光合細(xì)菌對(duì)鯉魚非特異性免疫功能的影響

cjlittlepig

摘自《水利漁業(yè)》

摘要：實(shí)驗(yàn)組光合細(xì)菌質(zhì)量濃度分別為2.5、5.0、10.0 g/m3，在第1、7、14、21、28天檢測(cè)鯉魚血液白細(xì)胞吞噬活性和血清溶菌酶活性等指標(biāo)。結(jié)果表明，該光合細(xì)菌制劑可以提高鯉魚白細(xì)胞的吞噬活性，增強(qiáng)血清溶菌酶活力。鯉魚的非特異性免疫功能隨著光合細(xì)菌制劑濃度的增加和潑灑時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)增強(qiáng)趨勢(shì)。

關(guān)鍵詞：光合細(xì)菌 鯉魚 吞噬功能；溶菌酶活性

    隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，養(yǎng)殖產(chǎn)量的提高，水產(chǎn)動(dòng)物疾病頻發(fā)成為嚴(yán)重威脅水產(chǎn)業(yè)的一個(gè)突出問題。面對(duì)這一問題，水產(chǎn)工作者們開始尋找有效的解決方法。20世紀(jì)50年代抗生素廣泛地應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)，70年代人們認(rèn)識(shí)到其在帶來巨大效益的同時(shí)也帶來許多副作用⋯1，因此，人們開始尋找更加有效健康的藥物。近年來，維生素、中草藥、脂多糖、甲殼質(zhì)、肽聚糖，微生態(tài)制劑等免疫增強(qiáng)劑成為魚病防治研究的新熱點(diǎn)。微生態(tài)制劑不僅可凈化水質(zhì)，無藥物殘留，不產(chǎn)生抗藥性，而且可以促進(jìn)魚類生長(zhǎng)，提高其對(duì)環(huán)境的耐受力和應(yīng)激力，產(chǎn)生非特異性免疫調(diào)節(jié)因子，提高機(jī)體免疫力[2]。我們研究光合細(xì)菌制劑對(duì)魚類免疫機(jī)能的影響，探討其作用機(jī)理，為微生態(tài)制劑作為魚類疾病防治的藥物提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)魚鯉來自湖北宜昌市養(yǎng)殖基地.體質(zhì)健壯，無病元傷，質(zhì)量(80±7.5)g，共200尾。

1.1.2 養(yǎng)殖條件

水泥池4個(gè)(3.0 m×3.0 m×0.5m)，每個(gè)池子放5O尾鯉，1號(hào)池為對(duì)照組。水溫20～25℃ ，溶氧5～6 mz／L，pH為6.8左右。1周換水1次(換池水的50％)。馴養(yǎng)2周后開始試驗(yàn)。

1.1.3 飼料及投喂飼料購于武漢海大飼料有限公司，為l號(hào)鯉魚配合飼料。每天投喂2次，投餌率3％～5％，以吃飽剩少許為準(zhǔn)。

1.1.4 金黃色葡萄球菌制備

    將金黃色葡萄球菌接種于淡水魚類瓊脂培養(yǎng)基斜面上，28℃下培養(yǎng)24-48 h。無菌生理鹽水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.65％)洗下菌落，并稀釋成一定濃度，加入終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的福爾馬林，28℃滅活24 h，用無菌生理鹽水清洗3次，調(diào)整細(xì)菌密度至1×108／ml，保存于4℃冰箱中備用。

1.1.5 微生態(tài)制荊

    試驗(yàn)所用光合細(xì)菌制劑(PSB)系華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)所培養(yǎng)，主要成分為沼澤紅假單胞菌，菌密度為5億～10億／g。實(shí)驗(yàn)組每7d投放菌液1次，每次劑量為1.0 g／m3，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行35 d。

1.1.6 溶壁微球菌購于中科院北京微生物研究所中國普通微生物菌種保藏中心。

1.2 方法

1.2.1 溶壁微球菌的配制

    將溶壁微球菌涂布于營養(yǎng)瓊脂上，28℃ 下培養(yǎng)過夜，以制備溶壁微球菌粉末，具體操作見參考文獻(xiàn)[3]。

1.2.2 血清及血細(xì)胞的收集

    從鯉魚尾靜脈采血，一部分直接加入Eppendorf(1.5ml尖頭離心管)中以制備血清，用于溶菌酶測(cè)定，另一部分用來(無菌肝素鈉)抗凝，供測(cè)定白細(xì)胞吞噬活性。

1.2.3 吞噬細(xì)胞吞噬功能的測(cè)定

    參考文獻(xiàn)[4]的方法。每次從尾靜脈取血1ml，置于含0.5ml肝素溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2％)的試管中混勻，加入約0.5 mL的金黃色葡萄球菌液，充分混勻后于25℃ 下水浴60 min。水浴期間每隔10 min搖勻1次。取上述混合液涂片，每個(gè)血樣涂5片。自然晾干后滴加甲醇固定5～7 min，蒸餾水沖洗，Gien~a染色1～1.5 h，自來水沖洗后再用蒸餾水沖洗，晾干。油鏡觀察記錄結(jié)果。吞噬活性分別以吞噬百分比(Phagocytic Percentixge，PP)和吞噬指數(shù)(Phagocyticindex，PI)表示：

    吞噬百分比(PP)=(100個(gè)吞噬細(xì)胞中參與吞噬的細(xì)胞數(shù)／100)×100％，

    吞噬指數(shù)(PI)=(吞噬細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌總數(shù)／參與吞噬的吞噬細(xì)胞數(shù))×100％

1.2.4 溶菌酶活力的測(cè)定

    主要依據(jù)文獻(xiàn)[5,6]的方法進(jìn)行。用0.067 mol／L PBS(pH 6.4)將溶壁微球菌配成0.2 mg／mL的菌懸液，每個(gè)樣品取3ml菌懸液，吸取40μL血清加入到3 mL菌懸液中混勻后立刻在540nm下測(cè)定A0值。然后在28℃ 水浴中溫育30min，取出后置于4℃水浴中以終止反應(yīng)，再測(cè)定A值，按公式計(jì)算溶菌酶活力u=( A0一A)／A0。

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2 結(jié)果
2.1 光合細(xì)菌對(duì)鯉魚吞噬功能的影響
    光合細(xì)菌制劑處理組與對(duì)照組的鯉魚白細(xì)胞吞噬活性見表1。
    結(jié)果顯示，光合細(xì)菌制劑處理的鯉魚，吞噬細(xì)胞的吞噬活性比對(duì)照組要高，且隨著時(shí)間的增加而增強(qiáng)。t檢驗(yàn)表明，3個(gè)試驗(yàn)組白細(xì)胞的吞噬百分比和吞噬指數(shù)均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。
2.2 光合細(xì)菌對(duì)鯉魚血清中溶菌酶活力的影響
    測(cè)定結(jié)果見表2。
    施用光合細(xì)菌制劑后，鯉魚血清中溶菌酶的活力有明顯的提高，10.0 g／m3組的溶菌酶活力變化最大，且隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈增高趨勢(shì)，第28天達(dá)到最高水平。經(jīng)t檢驗(yàn)，施用了光合細(xì)菌的3個(gè)實(shí)驗(yàn)組鯉魚血清溶菌酶水平都明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。1 g／m3組的效果最好，這與制劑使用說明吻合，明顯地提高了鯉魚血清溶菌酶的活力，從而增強(qiáng)了鯉魚非特異性免疫功能以及抵抗病原微生物感染的能力。

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3 討論
    關(guān)于光合細(xì)菌對(duì)魚類血清中溶菌酶的影響，目前國內(nèi)尚未有研究報(bào)道，更多的是作為水質(zhì)凈化劑用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的研究，且取得了很大的成功，研究結(jié)果在日本、東南亞和我國臺(tái)灣等地得到了普遍的應(yīng)用[7] 。孫艦軍等[8]把光合細(xì)菌拌人飼料投喂中國對(duì)蝦22 d后發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)蝦的溶菌酶活力比對(duì)照組提高53.4％，而我們的實(shí)驗(yàn)在第28天后所得結(jié)果顯示溶菌酶活力提高超過了100％，這可能是研究的對(duì)象、藥物的施用技術(shù)以及環(huán)境條件不同所造成的。本試驗(yàn)的結(jié)果表明，施藥7 d后開始產(chǎn)生作用，并且在第28天效果最高。從結(jié)果看，制劑的作用效果隨時(shí)間延長(zhǎng)呈增強(qiáng)趨勢(shì)，這與簡(jiǎn)紀(jì)常等[2]研究中草藥提高建鯉溶菌酶活力的結(jié)果有不符之處，關(guān)于其持續(xù)作用時(shí)間還需進(jìn)一步的研究。
    關(guān)于光合細(xì)菌對(duì)魚類白細(xì)胞吞噬活性的影響，目前尚未發(fā)現(xiàn)報(bào)道，而其它的免疫增強(qiáng)劑對(duì)魚類白細(xì)胞的吞噬活性影響則有相關(guān)報(bào)道。劉云等[9]用甲殼胺添加于飼料中可提高鯽魚吞噬細(xì)胞的吞噬能力。本試驗(yàn)施用光合細(xì)菌制劑后，白細(xì)胞的吞噬活性得到了明顯的提高，但是施用劑量和施用方法有待進(jìn)一步研究。作為一種益生菌制劑，光合細(xì)菌制劑對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的病害防治前景十分廣闊.值得在今后養(yǎng)殖生產(chǎn)中大力推廣。在微生態(tài)制劑的研究中也存在許多問題[10]，比如優(yōu)良菌種的篩選，菌劑的保存技術(shù)、施用技術(shù)和劑量等，都有待深人地研究。

逆游的魚

哦、原來如此啊